TEST GENETICO BRCA: L'ESPERIENZA DI UN CENTRO DI ECCELLENZA

 
  TEST GENETICO BRCA: L'ESPERIENZA DI UN CENTRO DI ECCELLENZA
     
 

Intervista al prof. Ettore Capoluongo, responsabile dell’Unità Operativa semplice di Diagnostica molecolare clinica e personalizzata del Policlinico Universitario A. Gemelli, Roma

 
 
 

Come nasce un centro di diagnostica molecolare di eccellenza?

Il nostro centro è nato nel 2003, con l’obiettivo di rispondere a bisogni non ancora soddisfatti nell’ambito della diagnostica molecolare clinica.
Nel corso degli anni la nostra attività si è rivolta specialmente allo sviluppo di tecniche per l’analisi di target molecolari nuovi o caratterizzati da una specifica complessità. In particolare, l’attenzione del nostro laboratorio, che si trova all’interno del Dipartimento di Diagnostica e Medicina di Laboratorio del Policlinico Universitario Agostino Gemelli, si è focalizzata su test genetico-molecolari correlati ad aree di interesse clinico, riguardanti patologie oncologiche e metaboliche.

Il nostro laboratorio, che ha ottenuto la certificazione dalla Clinical Pathology Accreditation di Londra, opera secondo criteri di massima sicurezza e qualità, a partire dall’elevata specializzazione del personale, fino all’impiego di tecnologie di ultima generazione, seguendo procedure in accordo agli standard di qualità internazionali richiesti per l’esecuzione di questi test.

In particolare, il nostro laboratorio è stato tra i primi in Italia a introdurre nella pratica di laboratorio il sequenziamento massivo parallelo, definito come sequenziamento di seconda generazione (Next Generation Sequencing; NGS), che rappresenta una delle tecnologie più potenti al momento disponibile per il sequenziamento multi-genico e/o di geni a elevata complessità, quali BRCA1 e BRCA2. L’impiego di tali tecnologie, che hanno rivoluzionato la modalità di approccio alle sindromi genetiche e alle patologie complesse come il cancro, permette di analizzare in maniera simultanea numerosi campioni, generando una mole di dati davvero corposa. Ovviamente, tali tecnologie vanno a integrare quelle di prima generazione fino a oggi utilizzate per il sequenziamento.

     
     
 

In che cosa consiste l’analisi BRCA e quali sono le principali criticità legate al test?

Il test BRCA consiste non solo nell’analisi della sequenza genica per la ricerca di mutazioni, ma anche nell’analisi quantitativa che valuta il numero di copie del gene.
Le principali criticità correlate all’esecuzione del test per la valutazione delle mutazioni riguardano, oltre alla selezione clinica dei pazienti da sottoporre al test, tutti gli aspetti tecnici legati alla difficoltà di esecuzione dell’esame e all’analisi dei risultati.
I geni BRCA sono, infatti, tra i più grandi del nostro genoma, essendo composti da oltre 170.000 basi. La presenza di numerosi polimorfismi, oltre che di mutazioni introniche spesso di difficile interpretazione, al momento rende le procedure diagnostiche particolarmente complesse.

Per i due geni BRCA, inoltre, risultano identificate circa 3.800 mutazioni e 1.500 varianti genetiche a significato incerto (VUS), per le quali si stanno studiando le possibili conseguenze patogenetiche. A causa della lunghezza dei due geni, le analisi oggi si concentrano solo sulla parte codificante (51 esoni, per un totale di circa 16.000 nucleotidi) e sulle regioni di splicing che fiancheggiano ciascun esone; non è ben noto, invece, quale sia l’effetto delle mutazioni presenti nelle zone non-codificanti (in particolare sulle lunghe regioni introniche).

Un’ulteriore tappa cruciale nell’esecuzione del test è quella relativa all’interpretazione corretta dei risultati ottenuti. Per esempio, nel caso di un referto negativo, quando però le caratteristiche del paziente suggeriscono la presenza di difetti del sistema BRCA, il Centro che eroga l’analisi deve essere in grado di condurre analisi di secondo livello non solo sui geni BRCA ma anche su geni coinvolti in pathway correlati al sistema BRCA.
È ormai dimostrato, infatti, che oltre a BRCA1 e BRCA2, anche altri geni possono aumentare la suscettibilità individuale a uno specifico tumore o giustificare un fenotipo tumorale più aggressivo o una prognosi di malattia differente.

Per poter operare in questo modo sono necessarie un’elevata esperienza e una stretta interazione con i colleghi clinici, ovvero con chi è a diretto contatto con il paziente, soprattutto per una corretta gestione del paziente post-esame.
In una struttura come la nostra tale network è facilitato dalla presenza delle figure cliniche coinvolte nella gestione del paziente, quali oncologi, ginecologi, genetisti e biologi molecolari clinici.

Questa organizzazione, infatti, permette allo specialista di laboratorio di poter condividere le criticità dello specifico esame direttamente con le unità cliniche, di pianificare approfondimenti diagnostici finalizzati a una più accurata interpretazione dei risultati forniti dai software e di decidere, in base alla situazione clinica specifica, se eseguire eventuali test di secondo livello.

Grazie alla disponibilità delle nuove tecnologie di analisi molecolare oggi si stanno riscrivendo i dati epidemiologici relativi alle mutazioni BRCA nella popolazione femminile. La conoscenza della rilevanza clinica di tali mutazioni, infatti, così come la possibilità di offrire il test in maniera diffusa, permettono a sempre più donne a rischio, dopo un’attenta consulenza genetica e multidisciplinare, di accedere al test per conoscere lo stato mutazionale di BRCA e, se necessario, di poter intervenire tempestivamente con adeguate misure di profilassi o terapeutiche.

 

     
 
   

Qual è l’esperienza del centro di eccellenza di diagnostica molecolare nell’esecuzione del test BRCA?

Presso il nostro laboratorio vi sono quattro persone altamente specializzate dedicate all’esecuzione del test BRCA e sono presenti due sequenziatori massivi, uno che permette un sequenziamento più rapido e che viene utilizzato per le urgenze, e un secondo caratterizzato da una maggiore capacità di analisi, che consente di processare 40-100 campioni contemporaneamente.

Il tempo medio di esecuzione dei test sui geni BRCA può variare da 2 a 4 settimane. Nello specifico, la fase di sequenziamento massivo dura 5 giorni, a cui seguono 2 giorni per il trasferimento dei dati ai software che effettuano l’analisi bioinformatica e alcuni giorni per la refertazione. Ogni analisi è seguita da un test di conferma, della durata di 2 giorni, con sequenziamento Sanger, considerato oggi ancora il gold standard.

È possibile affermare che i tempi di refertazione di questo test presso il nostro laboratorio sono molto rapidi, considerando che con sequenziatori di prima generazione sarebbero necessari quattro mesi circa per ottenere un referto, soprattutto in laboratori non dotati di elevata automazione.

La rapidità con cui si giunge a un referto è ovviamente fondamentale per permettere ai clinici una pianificazione tempestiva di eventuali strategie profilattiche o di interventi terapeutici.
Grazie all’esperienza maturata dal nostro centro in questo ambito, abbiamo recentemente pubblicato due articoli scientifici nei quali dimostriamo come l’impiego corretto delle metodiche di sequenziamento massivo parallelo permette di anticipare la diagnosi, con un risparmio in termini di tempi e costi (1,2). Abbiamo avuto l’onore di presentare tali dati al recente Congresso Internazionale sulle Tecnologie di Sequenziamento NGS (6th Next Generation Sequencing Congress) tenutosi a Londra lo scorso novembre, dove abbiamo condiviso, con numerosi esperti del settore, i contenuti della piattaforma (pipeline) NGS per il sequenziamento di BRCA, da noi messa a punto. Tale pipeline è stata particolarmente apprezzata per l’elevato numero di passaggi di controllo di qualità che contraddistingue ogni step del test, garantendo risultati utili sotto il profilo clinico (1,2).

Come indicato dalle linee guida EuroGentest, è fondamentale che tutti i laboratori che effettuano i test genetico-molecolari siano in grado di operare secondo gli standard richiesti e di disporre, non solo di tecnologie aggiornate, ma anche di personale qualificato e sottoposto a continuo aggiornamento. Per ottenere risultati affidabili, infatti, è necessaria un’elevata expertise nelle tecniche di sequenziamento, sia di prima, sia di ultima generazione, in particolare per quanto riguarda il passaggio più importante, l’analisi del dato e la successiva modalità di refertazione dello stesso.

Il nostro laboratorio è da anni sede della Scuola di Formazione permanente in Biologia Molecolare Clinica, afferente alla principale società nazionale di medicina di laboratorio, la Società Italiana di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica (SIBioC), che provvede annualmente a formare (attraverso diversi percorsi) e a certificare i professionisti che operano nel campo della diagnostica molecolare.

In conclusione, è importante poter offrire al paziente che si sottopone a un’analisi genetica un percorso lineare e completo, a partire dalla presa in carico del paziente per la valutazione della candidabilità all’esecuzione del test attraverso uno specifico counselling genetico e multidisciplinare, fino all’esecuzione del test secondo criteri standardizzati e a un’accurata interpretazione dei risultati.

 
 
 

Referenze bibliografiche
1. Concolino P, Costella A, Minucci A, Scaglione GL, Santonocito C, Salutari V, Scambia G, Zuppi C, Capoluongo E. A preliminary Quality Control (QC) for next generation sequencing (NGS) library evaluation turns out to be a very useful tool for a rapid detection of BRCA1/2 deleterious mutations. Clin Chim Acta 2014; 437: 72-7.
2. Concolino P, Mello E, Minucci A, Santonocito C, Scambia G, Giardina B, Capoluongo E. Advanced tools for BRCA1/2 mutational screening: comparison between two methods for large genomic rearrangements (LGRs) detection. Clin Chem Lab Med 2014; 52: 1119-27.