LA BIOPSIA LIQUIDA IN ONCOLOGIA

LA BIOPSIA LIQUIDA IN ONCOLOGIA

 
 
 

La biopsia liquida in oncologia

È noto come spesso le patologie tumorali siano dovute a mutazioni genetiche e come l’analisi di queste mutazioni tumore-correlate venga frequentemente utilizzata a scopo diagnostico, prognostico e terapeutico. Il profilo genetico dei tumori solidi, che attualmente viene effettuato principalmente sui tessuti prelevati dal tumore stesso tramite biopsia o intervento chirurgico, spesso è difficile da ottenere. Queste procedure hanno alcune limitazioni: in primo luogo, a causa della loro invasività, non possono essere svolte routinariamente. Un secondo limite è rappresentato da un bias di selezione del campione: infatti, una biopsia fornisce una fotografia limitata del tumore, nel sito del prelievo e nel momento del prelievo, e potrebbe non contenere tutti i sub-cloni tumorali. Poiché le cellule tumorali apoptotiche o in necrosi liberano frammenti di DNA nel torrente ematico, e questo DNA correla con lo stadio del tumore e con la prognosi, la biopsia liquida può rappresentare invece una fonte di DNA ottimale, in grado di offrire le medesime informazioni del DNA tissutale, comprendendo il profilo genetico sia della lesione primaria, sia delle metastasi. In un primo tempo questa tecnica è stata limitata dal fatto che il DNA circolante non fosse unicamente di origine tumorale e quindi l’identificazione di alleli tumorali fosse complessa: con il miglioramento della sensibilità e dell’accuratezza delle tecniche di sequenziamento, anche la biopsia liquida si è perfezionata e ha reso possibile l’individuazione delle aberrazioni genetiche ed epigenetiche. La biopsia liquida attualmente offre un elevato grado di specificità: questo significa che è in grado di fornire dati robusti e riproducibili in modo semplice e non invasivo. Ciò è stato dimostrato anche da studi recenti sul carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) che hanno valutato lo stato mutazionale di EGFR, da cui emergono, nel confronto tra DNA circolante e DNA tissutale, una concordanza del 93,4%, una specificità del 99,8% e una sensibilità del 65,7%. Potrebbe essere utilizzata per una varietà di applicazioni cliniche e sperimentali precedentemente impossibili: il monitoraggio di una serie di genotipi tumorali, che sono instabili e, sotto pressione selettiva, soggetti a cambiamenti, sta diventando sempre più plausibile. La biopsia liquida, inoltre, potrebbe fornire nuove intuizioni biologiche nel processo di metastasi e chiarire vie di segnalazione coinvolte nei processi di invasività cellulare e nella capacità di dare metastasi. La biopsia liquida può trovare grande utilità anche nella target therapy: consente per esempio il monitoraggio della presenza di cloni di resistenza ai farmaci, come nel caso della terapia anti-EGFR. Ulteriori potenziali applicazioni della biopsia liquida potrebbero essere lo screening precoce delle neoplasie maligne e la diagnosi della malattia minima residua. Infine, la biopsia liquida può divenire fondamentale come biomarker non invasivo per lo sviluppo di strategie di gestione del tumore personalizzate sul singolo paziente.

   

Referenze bibliografiche

 

Crowley E, Di Nicolantonio F, Loupakis F, Bardelli A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat Rev Clin Oncol. 2013; 10(8):472-84.
Diaz LA Jr, Bardelli A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J Clin Oncol. 2014; 32(6):579-86.
Douillard JY, et al. Gefitinib treatment in EGFR mutated Caucasian NSCLC: circulating-free tumor DNA as a surrogate for determination of EGFR status. J Thorac Oncol. 2014; 9(9):1345-53.
Esposito A, Bardelli A, Criscitiello C, et al Monitoring tumor-derived cell-free DNA in patients with solid tumors: clinical perspectives and research opportunities. Cancer Treat Rev. 2014; 40(5):648-55.
Ilie M, Hofman V, Long E, Bordone O, et al. Current challenges for detection of circulating tumor cells and cell-free circulating nucleic acids, and their characterization in non-small cell lung carcinoma patients. What is the best blood substrate for personalized medicine? Ann Transl Med. 2014; 2(11):107.
Lebofsky R, Decraene C, Bernard V, et al. Circulating tumor DNA as a non-invasive substitute to metastasis biopsy for tumor genotyping and personalized medicine in a prospective trial across all tumor types. Mol Oncol. 2015; 9(4):783-90.

LA BIOPSIA LIQUIDA MOLECOLARE IN ONCOLOGIA
Intervista al dott. Normanno, Cell Biology and Biotherapy Unit INT-Fondazione Pascale, Napoli

 

 

La biopsia liquida: quando e perché?

La biopsia liquida è stata approvata solo per l’analisi mutazionale di EGFR nei pazienti con carcinoma polmonare per i quali non è disponibile il tessuto. In particolare l’approvazione EMA afferma “when tissue is not an option”: quando il tessuto non è un’opzione percorribile. Quindi si intende mancanza di tessuto per poter eseguire il test mutazionale o tessuto non adeguato a causa di una scarsa quantità di cellule tumorali, o di altri motivi per i quali l’analisi fallisce. Tuttavia, una serie di studi clinici presentati recentemente ha suggerito che, in alcuni pazienti, il campione tissutale prelevato potrebbe essere non rappresentativo della malattia. Nello specifico, si potrebbe valutare l’opportunità di impiegare la biopsia liquida in presenza di un test negativo eseguito su un campione contenente scarso materiale, ad esempio poche decine di cellule neoplastiche, come a volte avviene nella pratica clinica. La decisione di ripetere il test su biopsia liquida potrebbe anche essere guidata dall’eventuale presenza di caratteristiche cliniche specifiche, associate a un’elevata frequenza di mutazione di EGFR (mai fumatore, sesso femminile, ecc).

   
 

Come deve essere eseguita una biopsia liquida e mediante quali metodiche viene analizzata?

Quando si parla di biopsia liquida per il test EGFR si fa riferimento a un’analisi mutazionale che viene eseguita su DNA tumorale libero circolante che può essere estratto dal sangue, più precisamente dal plasma prelevato dal paziente. In realtà esistono altri esempi di biopsia liquida, come l’analisi delle cellule tumorali circolanti, ma l’analisi del DNA tumorale circolante è l’applicazione che emerge dagli studi clinici e che è stata poi approvata dalle autorità regolatorie. C'è una serie di fattori pre-analitici che possono influire sul risultato delle analisi, di cui al momento si ha scarsa conoscenza e, di fatto, ancora non esistono protocolli standardizzati. La buona pratica indica comunque che, una volta effettuato il prelievo di sangue, il plasma viene isolato al massimo 2-3 ore dopo il prelievo. In seguito il plasma, se non immediatamente processato, deve essere eventualmente aliquotato e conservato alla temperatura di –20 °C o, ancora meglio, di –80 °C. Anche sui protocolli di analisi ci sono solo poche certezze. Gli studi che hanno portato all’approvazione della biopsia liquida hanno utilizzato un kit specifico. Non si può comunque escludere che altre metodiche possano essere altrettanto valide nell’individuazione delle mutazioni. Tuttavia, dovendosi riferire a quanto riportato in letteratura, attualmente c’è un unico kit commercialmente disponibile di cui abbiamo dati solidi, anche se prevedo che, nei prossimi mesi, saranno approvate altre metodiche per l’utilizzo diagnostico in vitro.

   
 

Quali sono le possibili applicazioni cliniche in oncologia della biopsia liquida, con un focus particolare su NSCLC?

In questo momento l’unica applicazione clinica approvata della biopsia liquida è l’analisi mutazionale di EGFR in pazienti con NSCLC candidati a una terapia con farmaci anti-EGFR e per i quali in qualche modo il tessuto per l’analisi mutazionale non è disponibile oppure l’analisi su tessuto è fallita. Vi è un grande interesse anche in altri ambiti oncologici per il possibile utilizzo della biopsia liquida, soprattutto per il monitoraggio molecolare della malattia, ma tutte queste applicazioni sono attuabili solo in ambito di ricerca e realizzabili in un contesto di protocolli clinici approvati da comitati etici. Quindi non devono influire sulla pratica clinica.

 

Quali sono i passaggi necessari per portare questa tecnica nella pratica diagnostica di routine?

I risultati degli studi clinici presentati all’ultimo Congresso Europeo sul carcinoma polmonare hanno evidenziato l’esistenza di notevoli criticità nell’esecuzione di un test mutazionale di EGFR su biopsia liquida, sia nella fase pre-analitica sia nella fase analitica. Manca ancora una standardizzazione dei vari step del processo, quindi in questo momento è necessario che l’analisi venga effettuata in laboratori altamente specializzati, che abbiano già un’esperienza nell’uso di tecniche di biologia molecolare ad alta sensibilità (real time PCR, ddPCR, ecc.) e soprattutto di analisi di biopsie liquide, per evitare possibili falsi positivi o falsi negativi, che potrebbero incidere significativamente sulla prognosi del paziente.

   

2015 ASCO Annual Meeting

 

La biopsia liquida in oncologia

L’analisi delle mutazioni geniche mediante biopsia liquida è un argomento di forte interesse in ambito oncologico, per i vantaggi che potrebbe offrire nella pratica clinica. Al recente congresso ASCO, svoltosi a Chicago dal 29 maggio al 2 giugno 2015, sono stati presentati i risultati di alcuni dei principali abstract dei numerosi studi in questo settore, di cui riportiamo una selezione dei più rilevanti, con particolare attenzione al tema della patologia polmonare.

   
 

Identificazione delle mutazioni geniche in diversi setting tumorali mediante analisi del ctDNA

Detection rate of actionable mutations in diverse cancers using a biopsy-free (blood) circulating tumor DNA assay.
Kurzrock R, et al. J Clin Oncol 33, 2015 (suppl; abstr 11004)
L’analisi del DNA libero mediante Next Generation Sequencing (NGS) costituisce un potente strumento per la valutazione e il monitoraggio del DNA tumorale circolante (ctDNA). Questo metodo è caratterizzato da elevata sensibilità (identifica oltre l’85% delle mutazioni di singoli nucleotidi sul tessuto dei pazienti con carcinoma avanzato) e specificità analitica (>99,9999%). In questo studio è stato valutato il ctDNA mediante NGS in una serie di 103 pazienti affetti da diverse neoplasie, tra cui carcinoma mammario (n=40) e carcinoma polmonare (n=40). I risultati hanno evidenziato la presenza di almeno 1 mutazione nel 75,7% dei campioni totali, mentre tra i 222 volontari sani analizzati è stata identificata 1 mutazione in 1 solo campione. L’80% delle mutazioni identificate, inoltre, costituiva un target per farmaci disponibili. L’analisi del ctDNA a livello plasmatico permetterebbe, quindi, di identificare un elevato numero di mutazioni in numerosi setting tumorali sulle quali è possibile intervenire terapeuticamente.

   
 

Valutazione precoce della risposta ai TKI mediante quantificazione delle mutazioni di EGFR nel plasma di pazienti con NSCLC

Early prediction of response to tyrosine kinase inhibitors by quantification of EGFR mutations in plasma of nonsmall cell lung cancer patients.
Marchetti A, et al. J Clin Oncol 33, 2015 (suppl; abstr 8079)
Numerosi studi hanno valutato la possibilità di identificare le mutazioni a carico di EGFR tramite biopsia liquida nei pazienti con NSCLC, ma la potenzialità di effettuare una quantificazione accurata di tali mutazioni non è stata ancora indagata. A questo scopo sono stati raccolti campioni plasmatici da 79 pazienti e i risultati avrebbero evidenziato un tasso di sensitività e specificità del test EGFR nel plasma vs tessuto del 72% e del 100% rispettivamente e una progressiva riduzione dell’indice semi-quantitativo durante il trattamento nel 90% dei casi. La quantificazione delle mutazioni a carico di EGFR a livello plasmatico, quindi, risulterebbe fattibile e la variazione dell’indice semi-quantitativo durante il trattamento potrebbe essere utile per la valutazione precoce della risposta e dell’identificazione di ricadute, con conseguenti rilevanti implicazioni nella gestione dei pazienti.

 

Biopsia liquida per la stratificazione terapeutica dei pazienti con carcinoma polmonare

A non-invasive liquid biopsy approach for therapeutic stratification of lung cancer patients.
Husain H, et al. J Clin Oncol 33, 2015 (suppl; abstr e19082)
La biopsia liquida del DNA tumorale circolante (ctDNA) permette di evitare il ricorso a biopsie tissutali invasive. Ciò è particolarmente importante nel carcinoma polmonare dove 1/3 circa dei pazienti non dispone di biopsia tissutale sufficiente e non può quindi accedere alle targeted therapy. In questo studio è stato sviluppato un metodo di riconoscimento delle mutazioni nelle cellule circolanti dei pazienti che avrebbe permesso di identificare alterazioni di sequenza a livelli >0,01%, con una specificità del 99,9%. È stata osservata, inoltre, un’elevata concordanza tra le mutazioni della sequenza e le traslocazioni identificate nel campione tumorale e nel plasma. Tale metodica consentirebbe quindi l’identificazione di alterazioni genetiche clinicamente rilevanti in maniera non invasiva in pazienti con carcinoma polmonare.

   
 

Analisi mutazionali dal sangue di pazienti con NSCLC avanzato per il monitoraggio dell’evoluzione della malattia

Serial mutational analysis to monitor disease evolution in blood from advanced non small cell lung cancer (NSCLC) patients (p).
Viteri Ramirez S, et al. J Clin Oncol 33, 2015 (suppl; abstr e19085)
Nei pazienti oncologici è utile effettuare più biopsie successive per monitorare l’evoluzione molecolare della malattia e la possibile comparsa o scomparsa di mutazioni chiave, specialmente di quelle correlate alla risposta alle targeted therapy. Poiché in una significativa percentuale di pazienti con NSCLC avanzato non è possibile effettuare più biopsie successive, la biopsia liquida rappresenta una valida alternativa. In questo studio è stato validato un metodo semi-quantitativo per determinare le mutazioni rilevanti a carico di EGFR, KRAS e BRAF nel DNA libero circolante (cfDNA) isolato da plasma o siero di 10 pazienti con NSCLC avanzato. È stato osservato che tra i pazienti che rispondono al trattamento con EGFR-TKI i livelli di EGFR variano, si riducono o scompaiono. Inoltre, la progressione radiologica e clinica alla targeted therapy sarebbe preceduta da un aumento del carico mutazionale e una buona risposta alle successive linee terapeutiche risulterebbe correlata nuovamente a una riduzione del livelli di mutazioni nel cfDNA. La quantificazione nel tempo delle mutazioni a carico di EGFR nel cfDNA rappresenterebbe quindi un nuovo metodo non invasivo per monitorare il decorso della malattia e correggere conseguentemente il trattamento nei pazienti con NSCLC.

   
 

Approccio non invasivo per la stratificazione dei pazienti con carcinoma polmonare candidabili alle targeted therapy

A comprehensive noninvasive approach for the stratification of lung cancer patients for targeted therapies.
Murphy DM, et al. J Clin Oncol 33, 2015 (suppl; abstr e22086)
In 1/3 circa dei pazienti con NSCLC non è disponibile tessuto tumorale sufficiente per effettuare l’analisi molecolare e tali pazienti non sono quindi eleggibili al trattamento con le targeted therapy. Il metodo di sequenziamento di nuova generazione del ctDNA LungSelect consente di valutare con elevata precisione e accuratezza mutazioni di una singola base, delezioni, inserzioni e traslocazioni geniche in pazienti con tumore polmonare avanzato, evidenziando un elevato grado di concordanza tra le alterazioni geniche identificate nel plasma e nel tessuto bioptico. Tale metodica, quindi, permetterebbe di identificare mutazioni geniche in maniera non invasiva, garantendo così a un maggior numero di pazienti con NSCLC di accedere al trattamento con targeted therapy.

   
 

Metodo per un’analisi genomica complessiva da cfDNA

A method for comprehensive genomic analysis of cell-free DNA.
Parpart-Li S, et al. Viteri Ramirez S, et al. J Clin Oncol 33, 2015 (suppl; abstr e22070)
La biopsia liquida del DNA cellulare tumorale (ctDNA) permette di evitare di condurre biopsie tissutali invasive a livello di lesioni metastatiche multiple nel corso della terapia. Tuttavia, la frazione di ctDNA ottenuta da un campione di sangue spesso è molto limitata e la maggioranza dei metodi analizza singole mutazioni hot-spot o solo un numero limitato di alterazioni geniche. Per superare questi limiti è stato sviluppato un metodo di analisi del ctDNA (PlasmaSelect) che identifica mutazioni e traslocazioni con un’elevata sensibilità e specificità. Tale metodica, infatti, è in grado di identificare alterazioni a livelli >0,10%, con un’elevata specificità. Analisi condotte in pazienti oncologici avanzati avrebbero evidenziato un’elevata concordanza tra le mutazioni delle sequenze somatiche e le traslocazioni identificate nel tessuto tumorale e nel plasma. Questo metodo, quindi, fornisce uno strumento non invasivo che consentirebbe alla biopsia liquida di identificare alterazioni geniche clinicamente rilevanti all’interno di una vasta gamma di loci genomici.